Ανθρώπινα αντισώματα κατά της Ανοσοσφαιρίνης του επίμυος (ΗΑΜΑ)

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Τα ΜΚΑ διαδραματίζουν αξιοσημείωτο ρόλο στην διάγνωση, σταδιοποίηση και την θεραπεία των κακοήθων όγκων του εγκεφάλου. Πληθώρα αντισωμάτων έχουν παραχθεί την τελευταία δεκαετία με την μέθοδο του υβριδώματος, και διαχωρίζονται μεταξύ τους απο τον ισότυπο και την συγγένεια τους προς το αντιγόνο. In vivo μελέτες παρουσιάζουν ότι μικρή ποσότητα του ΜΚΑ φθάνει στον όγκο, ακόμη και με την χρησιμοποίηση του "ιδανικού" αντισώματος. Η περιοχική χορήγηση του αντισώματος αυξάνει την πρόσληψη του απο τον όγκο (Lee και συν.1987, Malamitsi και συν.1988), και η χρήση τμημάτων του αντισώματος επιτρέπει την καλύτερη διείσδυση στον όγκο, σε σύγκριση με ολόκληρο το μόριο της ανοσοσφαιρίνης (Colapinto και συν.1988). Σήμερα έχουμε την δυνατότητα να "οπλίζουμε" τα ΜΚΑ με διάφορες ουσίες (ραδιοϊσότοπα, τοξίνες, χημειοθεραπευτικά φάρμακα) για να αυξήσουμε την αποτελεσματικότητα των ΜΚΑ στην διάγνωση και την θεραπεία των όγκων του εγκεφάλου. Ατυχώς όμως υπάρχει ένας σημαντικός περιορισμός στην in vivo κλινική εφαρμογή των ΜΚΑ. Αφού τα περισσότερα ΜΚΑ παράγονται απο τους επίμυες, η διέγερση του ανοσολογικού συστήματος του ανθρώπου εναντίον της ξένης πρωτείνης ήταν αναμενόμενη. Η αντίδραση αυτή είναι δοσο-εξαρτώμενη και κατευθύνεται αρχικά εναντίον της σταθερής περιοχής του μορίου του αντισώματος και εν συνεχεία επεκτείνεται σε ολόκληρο το μόριο (Courtenay-Luck και συν.1988).

Οι αντιδράσεις υπερευαισθησίας που μπορούν να προκληθούν με την χορήγηση των ΜΚΑ είναι 4 τύπων:

1) Αντίδραση τύπου Ι. Παριστά την κλασσική αλλεργικού τύπου αντίδραση σε κάθε αντιγόνο και εκδηλώνεται είτε με ήπια συμπτώματα αλλεργικής επιπεφυκίτιδας, ρινίτιδας, κνιδώσεως και ελαφράς ασθματικής προσβολής, είτε με σοβαρή αναφυλακτική αντίδραση. Ο μηχανισμός δράσης βασίζεται στην παραγωγή της ανοσοσφαιρίνης IgE, το μόριο της οποίας συνδέεται με τους Fc υποδοχείς των μαστοκυττάρων που ευαισθητοποιούνται και διεγείρεται η αποκοκκίωση τους όταν εκτεθούν στο αντιγόνο. Η απελευθέρωση χημικών ουσιών μετά την αποκοκκίωση ευθύνεται για τις ανωτέρω κλινικές εκδηλώσεις.

2) Αντίδραση τύπου ΙΙ. Χαρακτηρίζεται απο την απελευθέρωση ανοσοσφαιρινών IgG.Η ανοσοσφαιρίνη IgG προκαλεί αντίδραση σε δύο περιπτώσεις: α) Οταν η παραγόμενη ανοσοσφαιρίνη δεν προκαλεί μόνο κάθαρση του αντιγόνου, αλλά παρουσιάζει διασταυρούμενη αντίδραση με τα αντιγόνα του φυσιολογικού ιστού και β) Οταν δημιουργούνται ανοσοσυμπλέγματα. Οι κλινικές εκδηλώσεις εξαρτώνται απο το όργανο το οποίο έχει προσβληθεί.

3) Αντίδραση τύπου ΙΙΙ. Χαρακτηρίζεται απο την δημιουργία και την κυκλοφορία ανοσοσυμπλεγμάτων, τα οποία παγιδεύονται στα τριχοειδή αγγεία των ιστών, προκαλούν ενεργοποίηση του συμπληρώματος με τελικό αποτέλεσμα την καταστροφή των προσβληθέντων ιστών. Τα συμπτώματα εκδηλώνονται 8-24 ώρες μετά την χορήγηση του ΜΚΑ με αρθραλγίες, πυρετό και κνίδωση.

4) Αντίδραση τύπου ΙV. Χαρακτηρίζεται απο την ενεργοποίηση του ειδικού για το αντιγόνο Τ-λεμφοκυττάρου που μεταναστεύει στο σημείο χορήγησης του αντιγόνου και προκαλεί τοπική κυτταρική αντίδραση .Κύριος εκπρόσωπος του τύπου αυτού είναι η δερματική δοκιμασία της φυματιώσεως.

Έχει βρεθεί, ότι ένα μεγάλο ποσοστό απο τα χορηγούμενα για θεραπευτικούς σκοπούς ΜΚΑ αδρανοποιούνται απο αντι-Ig αντισώματα τα οποία είχαν αναπτυχθεί στον λήπτη απο προηγούμενη χορήγηση (Zimmer και συν 1988). Ως επακόλουθο αυτού, η ποσότητα του θεραπευτικού αντισώματος που συγκεντρώνεται στον όγκο να είναι πολύ μικρή και να μειώνεται περαιτέρω μετά απο επανάληψη της χορήγησης, διότι ο τίτλος των ανθρωπίνων αντισωμάτων κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος (ΗΑΜΑ) αυξάνει. Η in vivo δημιουργία ανοσοσυμπλεγμάτων μονοκλωνικού αντισώματος/ανθρωπίνου αντισώματος μπορεί να οδηγήσει σε τύπου ΙΙΙ αντίδραση υπερευαισθησίας, η οποία μπορεί να προκαλέσει φλεγμονώδη αντίδραση με σοβαρές επιπτώσεις επί των ιστών (Steward 1987).

Όλοι οι ασθενείς οι οποίοι έλαβαν για θεραπεία ή για διάγνωση μονοκλωνικά αντισώματα σεσημασμένα με ραδιοϊσότοπα, ελέγχθηκαν για την ανάπτυξη ανθρωπίνων αντισωμάτων κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος (ΗΑΜΑ) . Χρησιμοποιήσαμε δύο μεθόδους για μεγαλύτερη ακρίβεια των μετρήσεων και συγκριτικό έλεγχο των αποτελεσμάτων.

Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

1. ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΡΑΔΙΟΑΝΟΣΟΜΕΤΡΗΣΗΣ

Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντιδραστήρια:

α) Πρωτεΐνες

-Ανοσοσφαιρίνη επίμυος
-Βόιος λευκωματίνη 5%
-Γάλα 5%

β) Αντισώματα

-Κεκαθαρμένο αντιανθρώπινο
-αντίσωμα κονίκλου (RAHA)*

γ) Χημικές ενώσεις

-Φωσφορικό διάλυμα (PBSA)
-Tween 20

δ) Ραδιοισότοπα

-125-Ιώδιο
-131-Ιώδιο

ε) Μέθοδος σημάνσεως -Δια ιωδογονίου με ειδική δραστηριότητα 5mCi/mg

Σε όλα τα δείγματα μετά την ραδιοσήμανση έγινε ποιοτικός έλεγχος με τις μεθόδους της καθίζησης με τριχλωροοξικό οξύ, της υγρής χρωματογραφίας και αξιολόγηση της αντισωματικής ικανότητας του αντι-ανθρωπίνου αντισώματος κονίκλου με υπερεπάρκεια αντιγόνου.

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΜΕΘΟΔΟΥ

-Χρησιμοποιήθηκε ειδική πλαστική επιφάνεια ELISA και έγιναν διπλά δείγματα

-Τοποθετούμε σε κάθε φρεάτιο 50μg ανοσοσφαιρίνης του επίμυος σε συγκέντρωση 0,5μg/φρεάτιο και επωάζουμε σε ειδικό κλίβανο διοξειδίου του άνθρακος για 12 ώρες.

-Εκλπυση της πλάκας ELISA με διάλυμα PBSA/Tween 3*5 λεπτά

-Προσθήκη σε κάθε φρεάτιο 200μl 5% βοίου λευκωματίνης ή 5% γάλα ή 10% εμβρυικού ορού και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες.

-Εκπλυση ως ανωτέρω

-Προσθήκη του ορού των ασθενών και επώαση για 1 ώρα

-Εκπλυση ως ανωτέρω

-Προσθήκη σεσημασμένου με 125-Ι ή 131-Ι αντι-ανθρωπίνου αντισώματος κονίκλου 100.000 κρούσεις /λεπτό/φρεάτιο και επωάζουμε για 1 ώρα

-Εκπλυση ως ανωτέρω και μέτρηση στον γ-counter κάθε φρεάτιο κεχωρισμένα (σχ.27).

Το διάλυμα Tween αναπτύσει υδρόφιλες δυνάμεις με την ελαστική πλάκα ELISA και αποτρέπει την μη-ειδική σύνδεση. Η σύνδεση της ανοσοσφαιρίνης IgG με την ελαστική πλάκα γίνεται με υδρόφοβη αντίδραση και η σύνδεση της εξαρτάται απο τον τύπο της ελαστικής πλάκας.

*Μέθοδος καθαρισμού του RAHA

2. ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ELISA

Χρησιμοποιήθηκαν τα κάτωθι αντιδραστήρια:

α) Αντισώματα -Καθαρό αντι-ανθρώπινο αντίσωμα κονίκλου συνδεδεμένο με βιοτίνη*

β) Αντιδραστήρια

-Βιοτίνη
-Στρεπταβιδίνη συνδεδεμένη με αλκαλική φωσφατάση
-Υπόστρωμα αλκαλικής φωσφατάσης
-Διάλυμα διακοπής της αντιδράσεως 3Μ ΝαΟΗ.

γ) Πρωτείνες

-Ανοσοσφαιρίνη του επίμυος
-Βόιος λευκωματίνη 5%
-Γάλα 5%

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

-Χρήση της ελαστικής πλάκας ELISA και δημιουργία διπλών δειγμάτων

-Τοποθετούμε 50μl/φρεάτιο ανοσοσφαιρίνης του επίμυος με συγκέντρωση 0,5μg/φρεάτιο και επωάζουμε σε ειδικό κλίβανο διοξειδίου του άνθρακος για 12 ώρες

-Εκπλυση της πλακός με διάλυμα PBSA/Tween 3*5 λεπτά

-Προσθήκη 200μΙ/φρεάτιο 5% βόιο λευκωματίνη ή 5% γάλα και επώαση για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου

-Εκπλυση ως ανωτέρω

-Προσθήκη του ορού των ασθενών και επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου.

-Εκπλυση ως ανωτέρω

-Προσθήκη του αντισώματος RAHA συνδεδεμένο με βιοτίνη σε δάλυση 1:500 σε PBSA.Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και έκπλυση στην συνέχεια

-Προσθήκη 50μΙ/φρεάτιο στρεπταβιδίνης συνδεδε-μένης με αλκαλική φωσφατάση σε διάλυση 1:1000 σε PBSA. Επώαση για 1 ώρα και έκπλυση

-Δημιουργία του υποστρώματος της αλκαλικής φωσφατάσης. Προσθήκη 100μΙ υποστρώματος σε κάθε φρεάτιο και ακολουθεί επώαση 20-30 λεπτά για την πλήρη ανάπτυξη του χρώματος. Το υπόστρωμα είναι φωτοευαίσθητο γι'αυτό συνιστάται επώαση σε σκοτεινό χώρο

-Τέλος μέτρηση στον μετρητή ELISA (σχ.28)

*Μέθοδος συνδέσεως του αντισώματος RAHA/Βιοτίνης

3. ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΝΤΙ-ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΚΟΝΙΚΛΟΥ

Διαπιστώσαμε απο μελέτες ότι τα αντισώματα που έχουν ληφθεί απο διάφορα ζώα και κυκλοφορούν στο εμπόριο, παρουσιάζουν διασταυρούμενη αντίδραση (cross reactivity) με την ανοσοσφαιρίνη του επίμυος. Λόγω της μη πλήρους καθαρότητος του αντισώματος του κονίκλου RAHA της εταιρείας DAKO αποφασίσαμε την κάθαρση του με την μέθοδο της υγράς χρωματογραφίας. Μετά την κάθαρση ακολούθησε έλεγχος των αντισωματικών ιδιοτήτων του αντισώματος του κονίκλου με την μέθοδο των μαγνητικών σφαιριδίων (beads).

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Αφαίμαξη 30 επίμυων και λήψη του ορού. Ειδική επεξεργασία καθαρισμού του ορού και απομόνωσης της πρωτεΐνης του ορού με την μέθοδο καθίζησης με την χρήση αλάτων θειικού αμμωνίου. Συνολικά ελήφθησαν συνολικά 32γρ. πρωτεΐνης.
Ακολούθησε η δημιουργία της χρωματογραφικής στήλης με την ενεργοποίηση της σεφαρόζης 4Β απο τα άλατα CNBr.
  -1γρ.της ξηράς σεφαρόζης δίδει 3,5ml γέλης
  -Υπολογισμός της σεφαρόζης, έκπλυση και διόγκωση με διάλυμα 1M HCL σε ειδικό Millipore δοχείο.
  -Αλκαλοποίηση του διαλύματος με νέο διάλυμα 0,1M NaHCO3/0,5M NaCL pH 8,3
  -Η ζέλη της σεφαρόζης και η πρωτεΐνη του επίμυος αναμιγνύονται σε συγκέντρωση 5-10mg πρωτεί-νης/γραμ. σεφαρόζης και επωάζονται υπο συνεχή ανάδευση σε θερμοκρασία 4 C.
  -Δημιουργία της στήλης και έκπλυση αυτής με το διάλυμα σύνδεσης
  -Κορεσμός των ελευθέρων ομάδων της σεφαρόζης με το διάλυμα κορεσμού 1Μ pH 4 0,5M NaCL και διατήρηση της στήλης με 0,19% azide σε θερμοκρασία 4 C.
Τα αντίσωμα RAHA IgG διέρχεται διαμέσου της στήλης σεφαρόζης. Έγινε σήμανση μικρής ποσότητος του αντισώματος RAHA με 125-Ιώδιο για να καταστεί δυνατή η ποσοτική μέτρηση της διασταυρουμένης αντίδρασης του αντισώματος κονίκλου και της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος. Μετά την δίοδο του αντισώματος κονίκλου δια της στήλης γίνεται έκπλυση με διάλυμα PBSA. Ακολουθεί διάλυμα κιτρικού οξέως με pH 4 δια της στήλης με σκοπό να εκπλύνει την στήλη και να κινητοποιήσει το ποσό του αντισώματος του κονίκλου που συνδέθηκε με την χρωματογραφική στήλη. Παράλληλα γίνεται συλλογή των κλασμάτων των εξερχομένων απο την στήλη και ταυτόχρονη καταγραφή της εξερχομένης πρωτεΐνης απο την στήλη με ειδικό καταγραφέα (σχ.29,30). Με την ανωτέρω μέθοδο γίνεται και η κάθαρση της ανοσοσσφαιρίνης IgM του κονίκλου (σχ.31).

ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΟΣ ΤΟΥ ΚΕΚΑΘΑΡΜΕΝΟΥ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΚΟΝΙΚΛΟΥ RAHA

Το αντίσωμα του κονίκλου είναι πιθανόν να παρουσιάσει αλλοιώσεις στο μόριο του λόγω της ανωτέρω επεξεργασίας την οποία είχε υποστεί. Προς τούτο κρίθηκε απαραίτητος ο έλεγχος της αντισωματικής του ικανότητος μετά την ολοκλήρωση της κάθαρσης του. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε την μέθοδο με τα μαγνητικά σφαιρίδια Dynabeadς M-450.

-Επώαση των σφαιριδίων με:

α. ανθρώπινη σφαιρίνη
β. ανοσοσφαιρίνη επίμυος
και
γ. ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη.

Το αντίσωμα RAHA αναγνωρίζει μόνο την ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη, ενώ δεν αναγνωρίζει τις δύο άλλες σφαιρίνες οι οποίες χρησιμοποιούνται ως αρνητικοί μάρτυρες.

-Γίνεται σήμανση μικρής ποσότητος καθαρού αντισώματος κονίκλου με 125-Ιώδιο και ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιείται μη-ειδικό αντίσωμα Μ-340 σεσημασμένο με 131-Ιώδιο.

-Επώαση των αντισωμάτων με τα μαγνητικά σφαιρίδια για 4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Ποσότητα ραδιενέργειας για κάθε αντίσωμα κυμαίνεται απο 60.000 έως 100.000 κρούσεις/λεπτό.

-Εκπλυση των σφαιριδίων με PBSA 3*5 λεπτά και μέτρηση των τελικών κρούσεων σε γ-counter.

Στον πίνακα 15 παρουσιάζονται αθροιστικά τα αποτελέσματα του ελέγχου. Διαπιστώθηκε ότι το αντίσωμα του κονίκλου διατηρεί τις αντισωματικές του ιδιότητες και αναγνωρίζει την ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη σε ποσοστό 30,66%. Αντίθετα το κλάσμα RAHA IgM έχει χάσει την αντισωματική του ιδιότητα και δεν χρησιμοποιήθηκε στην μελέτη των ασθενών.

4. ΣΥΝΔΕΣΗ ΤΗΣ ΒΙΟΤΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΚΟΝΙΚΛΟΥ

Η μέθοδος ονομάζεται βιοτινιλίωση είναι απλή και συνίσταται στα κατωτέρω:

-Δημιουργία διαλύματος του αντισώματος με 0,1M NaCO3 pH 9 σε συγκέντρωση 1mg/ml.
-Διάλυμα βιοτίνης με διμεθυλοσουλφοξείδιο σε συγκέντρωση 1mg/ml.
-Μείξη των δύο αντιδραστηρίων με αναλογία 50 μέρη αντισώματος προς 1 μέρος βιοτίνης ή 75μΙ διαλύματος βιοτίνης με 1ml διαλύματος αντισώματος
-Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 4 ώρες με συνεχή ανάδευση
-Διαπήδηση για 12 ώρες εντός διαλύματος PBSA ή αφαλάτωση του μείγματος κατόπιν διόδου διαμέσου χρωματογραφικής στήλης G-25.

Πίνακα 15

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΤΟΥ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΙΚΟΥ ΕΛΕΧΟΥ ΤΟΥ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ RAHA

 ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΚΑΤΑ ΤΗΣ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΤΟΥ ΕΠΙΜΥΟΣ

1. Σταθεροποίηση και έλεγχος της αποτελεσματικότητας των δύο μεθόδων μέτρησης

Για την αξιολόγηση της φυσιολογικής διασποράς της ΗΑΜΑ στον γενικό πληθυσμό, τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας των μεθόδων μας και τον καθορισμό του αρνητικού ορίου των μεθόδων μας, μελετήσαμε 85 ορρούς φυσιολογικών ανθρώπων της ευρύτερης περιοχής του BRISTOL οι οποίοι ελήφθησαν απο το κέντρο αιμοδοσίας του νοσοκομείου Southmead.

Στο σχ. 32 απεικονίζεται η αντίδραση ΗΑΜΑ στον γενικό πληθυσμό. Το ποσοστό ήταν 12% περίπου και δεν διαπιστώθηκε αξιοσημείωτη διαφορά μεταξύ των δύο μεθόδων.

2. ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ.

Συνολικά μελετήσαμε 19 ασθενείς που προσήλθαν στην νευροχειρουργική κλινική του νοσοκομείου μας για θεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα και έπασχαν απο κακοήθη χωροκατακτητική εξεργασία εγκεφάλου. Διαχωρίσαμε τους ασθενείς σε 4 κατηγορίες:

ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ Ι: Οι ασθενείς με γλοίωμα εγκεφάλου στους οποίους έγινε ενδοαγγειακή χορήγηση του ΡΑΣ.

ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΙΙ: Οι ασθενείς με γλοίωμα εγκεφάλου στους οποίους έγινε ενδοογκική χορήγηση του ΡΑΣ.

ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΙΙΙ: Οι ασθενείς με καρκινική μηνιγγίτιδα στους οποίους έγινε εφ'άπαξ χορήγηση ΡΑΣ ενδοραχιαίως.

ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΙV: Οι ασθενείς με καρκινική μηνιγγίτιδα οι οποίοι έλαβαν πολλαπλές δόσεις του ΡΑΣ ενδοραχιαίως.

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ Ι: 4 ασθενείς ανήκουν στην κατηγορία αυτή, οι οποίοι έλαβαν ενδοαγγειακώς το ΡΑΣ και ελέχθησαν 3-4 εβδομάδες μετά την θεραπεία. Όλοι οι ασθενείς παρουσίασαν υψηλούς τίτλους αντισωμάτων κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος μετά την θεραπεία (πίνακας 16).

Πίνακας 16

 ΤΙΤΛΟΙ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΗΑΜΑ ΜΕΤΑ ΕΝΔΟΑΓΓΕΙΑΚΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΤΟΥ ΡΑΣ

ELISA/wvl RIA/cpm

*wvl=μήκος κύμακος

*cpm=κρούσεις ανά λεπτό

ΘΕΤΙΚΟΣ ΜΑΡΤΥΡΑΣ: RIA=12.500 cpm ELISA=2,4wvl

ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ ΜΑΡΤΥΡΑΣ: RIA= 800 cpm ELISA=0,4wvl

Αναφυλακτική αντίδραση δεν διαπιστώθηκε σε κανένα ασθενή και ο έλεγχος του ορού με την μέθοδο της υγράς χρωματογραφίας ήταν αρνητική για ανοσοσυμπλέγματα. Κατά την επανάληψη του ελέγχου μετά 3 μήνες απο την ημέρα της θεραπείας διαπιστώσαμε χαμηλότερους τίτλους αντισωμάτων κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος. Η δερματική δοκιμασία με μονοκλωνικό αντίσωμα ήταν απολύτως αρνητική.

ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΙΙ: 3 ασθενείς συμπεριελήφθησαν στην κατηγορία αυτή και ο έλεγχος έγινε 4 εβδομάδες μετά την θεραπεία. Δεν διαπιστώθηκε αύξηση του τίτλου των ανθρωπίνων αντισωμάτων κατά της ανοσφαιρίνης του επίμυος (ΗΑΜΑ) σε κανένα ασθενή. Ο ασθενής Νο3 ο οποίος είχε εισέλθει στο στάδιο της ανίχνευσης και εν συνεχεία στο στάδιο της θεραπείας παρουσίασε τους ίδιους χαμηλούς τίτλους αντισωμάτων όπως και οι άλλοι δύο ασθενείς (πίνακας 17).

Πίνακας 17

ΤΙΤΛΟΙ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΗΑΜΑ ΜΕΤΑ ΕΝΔΟΟΓΚΙΚΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΤΟΥ ΡΑΣ

ELISA/wvl RIA/cpm

ΘΕΤΙΚΟΣ ΜΑΡΤΥΡΑΣ RIA=10.000 cpm ELISA=2,03wvl

ΑΡNΗΤΙΚΟΣ ΜΑΡΤΥΡΑΣ RIA=880 cpm ELISA=0,54wvl

Στους ασθενείς της κατηγορίας αυτής δεν έγινε επανέλεγχος, ούτε η δερματική δοκιμασία με μονοκλωνικό αντίσωμα.

ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΙΙΙ: 10 ασθενείς ανήκουν στην κατηγορία αυτή. Εγινε έλεγχος για την ύπαρξη ανθρωπίνων αντισωμάτων κατά της πρωτεΐνης του επίμυος στον ορό και το ΕΝΥ των ασθενών αυτών.

Τα αποτελέσματα απεικονίζονται στον πίνακα 18. Η αντίδραση των ασθενών στην χορήγηση του ΡΑΣ ήταν ποικίλη. Ο ασθενής Νο10 παρουσίασε υψηλούς τίτλους ανθρωπίνων αντισωμάτων κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος προ και μετα την θεραπεία, χωρίς να παρουσιάσει καμία αντίδραση κατά την διάρκεια της χορήγησης του ΡΑΣ. 3 ασθενείς (Νο 7-8-9) παρουσίασαν υψηλούς τίτλους ανθρωπίνων αντισωμάτων κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος μετά την θεραπεία. 5 ασθενείς (Νο 1-5) δεν παρουσίασαν αξιοσημείωτη διαφορά στους τίτλους των ΗΑΜΑ προ και μετά την θεραπεία. Τέλος ο ασθενής Νο6 παρουσίασε υψηλό τίτλο ΗΑΜΑ αρχικά μετά την θεραπεία και ο τίτλος μειώθηκε προοδευτικά με την πάροδο 9 μηνών.

Πίνακας 18

ΤΙΤΛΟΙ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΗΑΜΑ ΜΕΤΑ ΜΕΜΟΝΩΜΕΝΗ ΕΝΔΟΡΑΧΙΑΙΑ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΤΟΥ ΡΑΣ

ELISA/wvl RIA/cpm

 *Μ=μήνες

Σε 5 ασθενείς έγινε έλεγχος του τίτλου των ΗΑΜΑ στο ΕΝΥ. Δεν ανιχνεύσαμε αύξηση του τίτλου των ΗΑΜΑ προ και μετά την θεραπεία, ακόμη και στους ασθενείς με υψηλούς τίτλους ΗΑΜΑ στον ορό (πίνακας 19).

Πίνακας 19

ΤΙΤΛΟΙ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΗΑΜΑ ΣΤΟ ΕΝΥ ΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΤΗΣ ΚΑΤΗΓΟΡΙΑΣ ΙΙΙ

ELISA/wvl RIA/cpm

 ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ IV: 2 ασθενείς ανήκουν στην κατηγορία αυτή οι οποίοι έπασχαν απο καρκινική μηνιγγίτιδα ένεκα οξείας μυελογενούς λευχαιμίας ο ένας και λόγω μυελοβλαστώματος ο δεύτερος. Στους ασθενείς αυτούς έγιναν πολλές εγχύσεις ΡΑΣ ενδοραχιαίως προς θεραπεία, ένεκα υποτροπής της νόσου των μόνο στο ΕΝΥ. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται στον πίνακα 20.

Πίνακας 20

ΤΙΤΛΟΙ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΗΑΜΑ ΜΕΤΑ ΠΟΛΛΑΠΛΩΝ ΔΟΣΕΩΝ ΡΑΣ ΕΝΔΟΡΑΧΙΑΙΩΣ

ELISA/wvl RIA/cpm

 *Δ=Δόσεις

Ο ασθενής Νο1 έλαβε 4 δόσεις θεραπείας σε διάστημα 6 μηνών και παρουσίασε υψηλούς τίτλους ΗΑΜΑ 3 εβδομάδες μετά την πρώτη θεραπεία και οι τίτλοι παρέμειναν υψηλοί και μετά την επανάληψη των άλλων δόσεων. Αξιοσημείωτο επίσης είναι ότι παρά τους αρχικά υψηλούς τίτλους ΗΑΜΑ ο ασθενής δεν παρουσία-σε αλλεργική αντίδραση. Ο ασθενής Νο2 έλαβε 3 δόσεις θεραπείας και παρουσίασε την ίδια συμπεριφορά με τον πρώτο ασθενή.

Στους δύο αυτούς ασθενείς έγινε προσδιορισμός των ΗΑΜΑ και στο ΕΝΥ (πίνακας 21). Ο ασθενής Νο1 παρουσίασε αύξηση του τίτλου των ΗΑΜΑ στο ΕΝΥ μετά την 3η δόση θεραπείας, ενώ στον ασθενή Νο2 οι τίτλοι των ΗΑΜΑ παρέμειναν αμετάβλητοι και μετά την 3η θεραπευτική δόση του ΡΑΣ.

Στους ασθενείς της κατηγορίας αυτής έγινε εκτεταμένη φαρμακοκινητική μελέτη του ΡΑΣ στο αίμα και το ΕΝΥ μετά την επανάληψη της πρώτης θεραπευτικής δόσεως του ΡΑΣ. Επίσης έγινε in vivo αξιολόγηση της συμπεριφοράς του ΡΑΣ και μελέτη της αποβολής του δια των νεφρών. Για την ανίχνευση των ανοσοσυμπλεγμάτων στον ορό των ασθενών αυτών χρησιμοποιήσαμε ευμεγέθη χρωματογραφική στήλη Sephacryl S300 HR 16/60. Για τον έλεγχο της πιστότητας της χρωματογραφικής στήλης διήλθαν δια της στήλης σεσημασμένες με ραδιοισότοπα οι ανοσοσφαιρίνες IgG και IgM (σχ.33).

Πίνακας 21

ΤΙΤΛΟΙ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΗΑΜΑ ΣΤΟ ΕΝΥ ΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΤΗΣ ΚΑΤΗΓΟΡΙΑΣ IV

ELISA/wvl RIA/cpm

5. ΓΕΝΙΚΗ ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Ενα απο τα μεγαλύτερα προβλήματα που αναδύονται απο την εκτεταμένη χρήση των ΜΚΑ στην θεραπεία και την διάγνωση των όγκων του εγκεφάλου είναι η διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος του πάσχοντος στην ανοσοσφαιρίνη του επίμυος. Το αποτέλεσμα της διέγερσης αυτής είναι η κυκλοφορία εντός του ορού των ασθενών αντισωμάτων κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος (τύπου ΙΙ αντίδραση υπερευαισθησίας), που οδηγεί στην δημιουργία ανοσυμπλεγμάτων μεταξύ ανθρωπίνων αντισωμάτων και ανοσοσφαιρίνης του επίμυος με τελικό αποτέλεσμα την βλάβη των φυσιολογικών ιστών (τύπου ΙΙΙ αντίδραση υπερευαισθησίας).

Στην μελέτη αυτή έγινε προσπάθεια να αξιολογηθούν και να ταξινομηθούν οι παράγοντες οι οποίοι εμπλέκονται στην υπάρχουσα ή μη υπάρχουσα διέγερση του ανοσολογικού συστήματος των ασθενών που έλαβον για θεραπευτικό σκοπό ΡΑΣ.

Οι ασθενείς οι οποίοι έλαβαν το ΡΑΣ ενδοαγγειακά ανέπτυξαν υψηλούς τίτλους αντισωμάτων κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος μετά την θεραπεία. Δεν διαπιστώθηκε διαφορά στον τίτλο των αντισωμάτων ΗΑΜΑ μεταξύ ενδοφλεβίου και ενδοκαρωτιδικής έκχυσης του ΡΑΣ. Η δημιουργία των αντισωμάτων ΗΑΜΑ θέτει σημαντικό περιορισμό στην επανάληψη της χορήγησης του ΡΑΣ και ταυτόχρονα περιορίζει το θεραπευτικό εύρος της μεθόδου αυτής. Οι Nigel S.,Courtenay-Luck και συν.1986 αναφέρουν την ανίχνευση ανοσοσυμπλεγμάτων σε ποσοστό 10% στον ορό των ασθενών οι οποίοι έλαβαν ενδοφλεβίως δύο δόσεις ΡΑΣ. Εκ παραλλήλου αναφέρουν και ταχεία κάθαρση του χορηγηθέντος ΜΚΑ απο τον ορό του ασθενούς. Πιστεύουμε ότι η ταχεία ανάπτυξη αντισωμάτων κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος οφείλεται στην ταχεία διαμερισματοποίηση του χορηγηθέντος ΡΑΣ στα όργανα του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος.

Στους ασθενείς που χορηγήθηκε το ΡΑΣ ενδοογκικά δεν διαπιστώθηκε αύξηση του τίτλου των αντισωμάτων κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος. Ο ασθενής ο οποίος έλαβε 2 δόσεις απο το ίδιο ΜΚΑ για ανίχνευση κατ' αρχάς και θεραπεία αργότερα, παρουσίασε τους ίδιους χαμηλούς τίτλους αντισωμάτων ΗΑΜΑ μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας. Η αδυναμία του ΡΑΣ να διεγείρει το ανοσολογικό σύστημα του πάσχοντος πι-θανόν να οφείλεται στην χαμηλή ποσότητα του αντισώματος που κυκλοφορεί στο αίμα μετά την διάχυση του απο το τοίχωμα του όγκου. Βιβλιογραφικά αναφέρεται ότι απαιτούνται περισσότερα απο 10mg μονοκλωνικού αντισώματος για την διέγερση του ανοσοσλογικού συστήματος.

Οι ασθενείς οι οποίοι έλαβον το ΡΑΣ ενδοραχιαία παρουσίασαν ποικίλη αντίδραση. Σε 3 ασθενείς διαπιστώσαμε υψηλούς τίτλους αντισωμάτων ΗΑΜΑ, σε 5 ασθενείς ο τίτλος παρέμεινε σταθερός και ένας ασθενής είχε υψηλούς τίτλους προ και μετά την θεραπεία. Εις το ΕΝΥ ουδείς ασθενείς παρουσίασε αύξηση του τίτλου των αντισωμάτων ΗΑΜΑ. Η χορήγηση του ΡΑΣ έγινε διαμέσου καθετήρος Ommaya, ο οποίος είχε τοποθετηθεί εντός του μετωπιαίου κέρατος της δεξιάς πλαγίας κοιλίας του εγκεφάλου. Χορηγήσαμε το ραδιοϊσότοπο 131-Ιώδιο σε ποσότητα που εκυμαίνετο απο 30-80mCi. Το ΡΑΣ ακολούθησε την φυσιολογική κυκλοφορία του ΕΝΥ και η κάθαρση του απο το ΕΝΥ έγινε διαμέσου των πακχιονείων σωμάτων στην συστηματική κυκλοφορία (σχ.34). Η ποσότητα του ΜΚΑ που κυκλο-φορούσε στο αίμα ήταν ικανή να προκαλέσει διέγερση του ανοσολογικού συστήματος των ασθενών, παρ' όλα αυτά όμως η διέγερση εκδηλώθηκε μόνο σε 3 ασθενείς. Παρατηρήσαμε επίσης ότι οι ασθενείς που παρουσίασαν αύξηση του τίτλου των αντισωμάτων ΗΑΜΑ είχαν λάβει χαμηλότερες δόσεις ραδιενέργειας (30-45 mCi) σε σύγκριση με τους ασθενείς οι οποίοι είχαν χαμηλούς τίτλους ΗΑΜΑ μετά την θεραπεία. Πολύ πιθανόν η ποσότητα της ραδιενέργειας να επηρεάζει αρνητικά την διέγερση του ανοσολογικού συστήματος λόγω βλαπτικής επιδράσεως της επί των αντιγονοπαρουσιαστκών κυττάρων. Άλλος παράγοντας που συμβάλλει στην αδυναμία διέγερσης του ανοσολογικού συστήματος είναι η ανοσοκαταστολή των ασθενών αυτών απο τις θεραπευτικές μεθόδους που προηγήθηκαν δηλαδή την ακτινοθεραπεία και τις υψηλές δόσεις κορτιζόνης.

Η διαπίστωση ότι το ΕΝΥ στερείται υψηλών τίτλων αντισωμάτων ΗΑΜΑ, ακόμη και στους ασθενείς στους οποίους ο τίτλος των αντισωμάτων ΗΑΜΑ στον ορρό ήταν αυξημένος, αποτελεί σημαντική πληροφορία για την κατανόηση της συμμετοχής του ΚΝΣ στην ανοσολογική αντίδραση. Φαίνεται ότι οι λεπτομήνιγγες αποτελούν φραγμό στην είσοδο μεγαλομοριακών ενώσεων, όπως οι ανοσοσφαιρίνες, εντός του ΕΝΥ και τοιουτοτρόπως απογορεύουν την είσοδο εντός του ΕΝΥ των αντισωμάτων ΗΑΜΑ του ορού. Το αποτέλεσμα είναι η βραδεία κάθαρση του ΡΑΣ απο το ΕΝΥ που επιτρέπει την αύξηση του χρόνου της in vivo ακτινοβολίας των καρκινικών κυττάρων.

Στους ασθενείς της κατηγορίας IV έγινε συγκριτική μελέτη των αποτελεσμάτων μας με την φαρμακοκινητική καμπύλη καθάρσεως του ΡΑΣ απο το αίμα και το ΕΝΥ. Διαπιστώσαμε αύξηση του τίτλου των αντισωμάτων ΗΑΜΑ μετά την πρώτη θεραπεία. 6 μήνες αργότερα ακολούθησε η δεύτερη δόση θεραπείας, χωρίς οι ασθενείς να παρουσιάσουν αντίδραση υπερευαισθησίας. Ο ποιοτικός έλεγχος για την ανεύρεση ανοσυμπλεγμάτων στον ορό και το ΕΝΥ ήταν αρνητικός (σχ.35). Ο τίτλος των αντισωμάτων ΗΑΜΑ στον ορό ήταν υψηλός και η καμπύλη κάθαρσης του ΡΑΣ απο το αίμα ήταν ταχύτερη (σχ.36). Αυτό σημαίνει την δημιουργία του συμπλόκου αντίσωμα ΗΑΜΑ/σεσημασμένο ΜΚΑ που αδρανοποιεί το μονοκλωνικό αντίσωμα του επίμυος και διευκολύνει την ταχεία απομάκρυνση του απο τους νεφρούς. Φαίνεται όμως ότι το σύμπλοκο αυτό είτε αποβάλλεται δια των νεφρών, είτε μεταβολίζεται στο ΔΕΣ, είτε η σημερινή μέθοδος για την αποκάλυψη του είναι ανεπαρκής.

Ο ασθενής Νο1 έλαβε την τρίτη δόση θεραπείας 7 ημέρες μετά την προηγουμένη δόση, ενώ ο ασθενής Νο2 έλαβε την τρίτη δόση θεραπείας 2 μήνες μετά την δεύτερη δόση. Οι τίτλοι των αντισωμάτων ΗΑΜΑ εξακολουθούσαν να είναι υψηλοί και η κάθαρση του ΡΑΣ απο το αίμα των ασθενών ήταν όμοια με την προηγουμένη. Ανοσοσυμπλέγματα στον ορό και το ΕΝΥ δεν ανιχνεύθηκαν (σχ.37α,β). Ο ασθενής Νο1 παρουσίασε άνοδο του τίτλου των αντισωμάτων ΗΑΜΑ στο ΕΝΥ, χωρίς όμως ταυτόχρονη αύξηση της κάθαρσης του ΡΑΣ όπως απεικονίζεται στη καμπύλη κάθαρσης του σχ.38 και 42. Παρόμοια εικόνα κάθαρσης του ΡΑΣ απο το ΕΝΥ παρουσίασε και το σπινθηρογράφημα εγκεφάλου και η εξωτερική μέτρηση της ραδιενέργειας με ειδικό μετρητή (probe) (σχ.39). Ο ασθενής Νο2 είχε υψηλούς τίτλους αντισωμάτων ΗΑΜΑ στο αίμα με ταυτόχρονη αύξηση της κάθαρσης του ΡΑΣ απο το αίμα όπως απεικονίζεται στο σχ.40. Η τετάρτη δόση θεραπείας στον ασθενή Νο1 δεν παρουσίασε αξιοσημείωτη διαφορά στην φαρμακοκινητική του ΡΑΣ και στους τίτλους των αντισωμάτων ΗΑΜΑ (σχ.41) .

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ.

1) Η ενδοαγγειακή χορήγηση του ΡΑΣ προκαλεί άμεση διέγερση του ανοσολογικού συστήματος και δημιουργία ανθρωπίνων αντισωμάτων κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος που διαταράσσει την φαρμακοκινητική του ΡΑΣ στο αίμα και μειώνει σημαντικά την απόδοση του ΡΑΣ στον όγκο.

2) Η ενδοογκική χορήγηση του ΡΑΣ δεν προκαλεί διέγερση του ανοσολογικού συστήματος και οι τίτλοι των αντισωμάτων ΗΑΜΑ ανιχνεύθηκαν σε χαμηλή επίπεδα προ και μετά την θεραπεία.

3) Η ενδοραχιαία χορήγηση του ΡΑΣ φαίνεται να διεγείρει το ανοσολογικό σύστημα προς παραγωγή αντισωμάτων ΗΑΜΑ στο αίμα, ομως η θεραπευτική δράση της μεθόδου δεν επηρεάζεται καθώς επίσης δεν διαταράσσεται και η φαρμακοκινητική του ΡΑΣ στο ΕΝΥ.

4) Η ύπαρξη αντισωμάτων ΗΑΜΑ στον ορό του ασθενούς, επί περιοχικής (ενδοογκικά και ενδοραχιαία) χορήγησης του ΡΑΣ δρά ευεργετικά, διότι απομακρύνει ταχέως το σεσημασμένο μονοκλωνικό αντίσωμα απο το αίμα και έτσι ελαττώνει τον χρόνο έκθεσης των ευαίσθητων οργάνων (μυελός των οστών) στην ραδιενέργεια.

5) Η ανάπτυξη ανθρωπίνων μονοκλωνικών αντισωμάτων θα λύσει το πρόβλημα της διέγερσης του ανοσολογικού συστήματος του πάσχοντος, αλλά έως τότε θα πρέπει να συνεχιστούν οι προσπάθειες για την θεραπευτική χρήση των ήδη υπαρχόντων ΜΚΑ. Ως εκ τούτου είναι σημαντικό να ελαττώσουμε ή και να καταργήσουμε την αντίδραση των ασθενών κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος.

Η πρόκληση ανοσοκαταστολής και ανοσολογικής ανοχής ξένης πρωτεΐνης αποτελεί πρωταρχικό σκοπό της ανοσολογίας. Η στρατηγική που θα πρέπει να ακολουθηθεί για την πρόκληση ανοσολογικής ανοχής του ασθενούς έναντι της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος θα πρέπει κατά την γνώμη μου να είναι:

α. Η ελάττωση της αντιγονικότητος της χορηγουμένης ανοσοσφαιρίνης επιταχύνοντας την κάθαρση της in vivo, χρησιμοποιώντας αντι-Ig αντιορό.

β. Ελάττωση της αντιγονικότητος της ανοσοσφαιρίνης αφαιρώντας την αντιγονική περιοχή απο το ΜΚΑ με την βοήθεια της μηχανικής του DNA.

γ. Η in vivo παρεμπόδιση της συνάθροισης των ανοσοσφαιρινών που έχει βρεθεί οτι αυξάνει την αντιγονικότητα της ανοσοσφαιρίνης. Πιθανόν να υπάρχει και συνέργεια με ανοσοκατασταλτικά φάρμακα τύπου κυκλοσπορίνης Α.

δ. Η παρέμβαση μας στα Β-λεμφοκύτταρα με την χρήση αντιγόνου "αυτοκτονίας". και

ε. Η παρέμβαση μας στο επίπεδο των Τ-λεμφοκυττάρων αναστέλλοντας την ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων χρησιμοποιώντας ένα αντιλεμφοκυτταρικό μονοκλωνικό αντίσωμα.

copyright © 2001-2002