Α. ΥΛΙΚΑ
| 1. Χημικά Αντιδραστήρια
Λευκωματίνη Ορού Βοός (BSA) Sigma Διάλυμα Ficoll Sigma Διμεθυλοσουλφοξίδιο (DMSO) Fisons PLC Εμβρυικός ορός βοός (FCS) Gibco Lab. Χλωροφόρμιο Sigma Ιωδογόνιο Sigma Χλωριούχο κάλιο (KCL) Fisons PLC Χλωριούχο νάτριο (NaCL) Fisons PLC Yδροξύλιο του νατρίου (NaOH) BDH Τριχλωροακετοοξικό οξύ Fisons PLC 2. Διαλύματα 0,1 Μ Κιτρικό διάλυμα pH 3 0,1 M κιτρικό οξύ τιτλοποιημένο σε pH 5 και 0,1Μ NaHPO4 Φωσφορικό διάλυμα (PBS) 8g/l NaCL 0,2g/l KCL 0,15g/L Na2HPO4 0,2g/l KH2PO4 pH 7,2 3. Aνοσολογικά αντιδραστήρια Αντίσωμα κονίκλου (Fab2)κατά της ανοσοσφαιρίνης του επίμυος σεσημασμένo με φλουορεσκείνη Dakopatts Αντιανθρώπιος ανοσοσφαιρίνη κονίκλου Dakopatts |
4. Χρωματογραφικά υλικά Σεφαντρέξ G-25 Pharmacia FC Σεφαντρέξ G-50 Pharmacia FC Πρωτείνη Α Σεφαρόζη 4Β Pharmacia FC 5. Μονοκλωνικά Αντισώματα 2D1 Dr. P.Beverly ICRF M-340 Dr. J.Kemshead ICRF UJ13A Dr. J.Kemshead ICRF ERIC-1 Dr. S.Bourne Brain tumor lab.Frenchay Bristol 81C6 Dr. D.Bigner Duke University USA 45.6 Brain tumor lab.Frenchay Bristol 6. Ραδιοϊσότοπα Ιώδιο-125 Amersham International Ιώδιο-131 Amersham International Υτριο-90 Celteck |
Β. Μ Ε Θ Ο Δ Ο Ι
Β.1. Τεχνική Ραδιοδημάνσεως του Αντισώματος
α. Μέθοδος Ιωδογονίου:
Παρασκευάζεται διάλυμα ιωδογονίου σε χλωροφόρμιο με συγκέντρωση 1mg/ml. Τοποθετούμε 50μl του διαλύματος εντός ειδικών υάλινων φυαλιδίων και με την χρήση πεπιεσμένου αέρα εξατμίζουμε το περιεχόμενο. Το ιωδογόνιο υπαλείφει τα τοιχώματα των φυαλιδίων. Διατηρούνται εντός ψυγείου -4ο C για 24 ώρες.
Εντός του φιαλιδίου με το ιωδογόνιο προστίθεται το μονοκλωνικό αντίσωμα και το ραδιοισότοπο με ειδική ραδιοδραστηριότητα 5-10 μCi/μg αντισώματος. Το μίγμα αναδεύεται και επωάζεται για 10 λεπτά.
Το μείγμα διέρχεται διαμέσου χρωματογραφικής στήλης σεφαντρέξ G-25 για τον διαχωρισμό του σεσημασμένου αντισώματος από το ελεύθερο ιώδιο. Το έκπλυμα συλλέγεται, μετράται η ραδιοδραστηριότητα του σε MBq και επιλέγονται 2-3 δείγματα με την υψηλότερη ραδιοδρα-στηριότητα, τα οποία μετά το φιλτράρισμα είναι έτοιμα προς χρήση.
Η χρωματογραφική στήλη είναι 10ml σεφαντρέξ-25, το οποίο έχει προηγουμένως διογκωθεί εντός διαλύματος PBS και επήλθε ιοντική ισορροπία με την δίοδο διαμέσου της στήλης διαλύματος PBS+2% ανθρώπινης λευκωματίνης.
β. Μέθοδος με το αντιδραστήριο ΑΤΕ [Ν-σουκινιμιδύλιο
3-(τρις-n-βουτυνοσταννυλο) βενζοικό οξύ].
Η μέθοδος αυτή έγινε στο εργαστήριο μας με την βοήθεια του χημικού κ. Pradeep Grag απο το πανεπιστήμιο του Duke των ΗΠΑ. Η βάση της μεθόδου είναι η ένωση ΑΤΕ (Ζalusky και Narula 1987). H ένωση ΑΤΕ συντίθεται απο το m-βρωμοβενζοικό οξύ. Τα στάδια της ραδιοσημάνσεως είναι:
-Εντός σωλήνος 1ml που περιέχει το ραδιοισότοπο προστίθεται διάλυμα 1% ακετοοξικού οξέως σε χλωροφόρμιο και διορθώνεται το pH=5,5.
-Προστίθενται, 15μl διαλύματος 9% t-βουτυλυδρουπεροξιδίου σε χλωροφόρμιο 13μmol και 10μl διαλύματος 0,1 Μ ΑΤΕ σε χλωροφόρμιο.
-Το ανωτέρω μείγμα αραιώνεται περαιτέρω με 50μl χλωροφορμίου και επωάζεται 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου προς ολοκλήρωση της αντίδρασης.
-Το μείγμα προστίθεται σε Silika Sep-Pak cartridge (Millipore) και επλύεται διαδοχικά με 30ml εξανίου, 25ml 8% διαλύματος εθυλοακε-τοξικού οξέως σε εξάνιο και 3ml διαλύματος 30% εθυλοακετοοξικού οξέως σε εξάνιο. Το Ν-σουκιμιδύλιο 3-(131-Ι ή 125-Ι) ιωδοβενζοικό οξύ εκπλύεται περαιτέρω με 15ml διαλύματος 30% εθυλακετοοξικού οξέως σε εξάνιο, συγκεντρώνεται και εξατμίζεται εντός ειδικού υαλίνου φιαλιδίου.
-Το μονοκλωνικό αντίσωμα (200μg σε 50μl βορικού διαλύματος pH 8,5) προστίθεται εντός του φιαλιδίου και το μείγμα επωάζεται 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η αντίδραση διακόπτεται με 300μl διαλύματος 200mM γλυκίνης σε βορικό οξύ.
-Τέλος το διάλυμα διέρχεται διαμέσου χρωματογραφικής στήλης σεφαντέξ-25 προς διαχωρισμό των κλασμάτων του μείγματος.
Β.2. Εκτίμηση της ραδιοχημικής καθαρότητος του μείγματος δια της καθιζήσεως με τριχλωροακετοξικό οξύ (TCA)
Εντός φιαλιδίου Eppendorf αναμειγνύουμε 10% TCA, 400μl PBS+2% λευκωματίνη και 50.000 κρούσεις/λεπτό ραδιοσεσημασμένο αντίσωμα. Το μείγμα επωάζεται για 15 λεπτά και γίνεται μέτρηση στο γ-counter.
-Το μείγμα φυγοκεντρείται, εκπλύεται με 400μl διαλύματος TCA και επαναφυγοκεντρείται.
-Αφαιρείται το υπερκείμενο διάλυμα και μετρούμε τις κρούσεις/λεπτό στο ίζημα, το οποίο παριστά το σεσημασμένο αντίσωμα που καθιζάνει με το TCA.
Β.3. Μέτρηση του ανοσολογικά ενεργού κλάσματος
Ως αντιγόνο στην μέτρηση αυτή χρησιμοποιούμε ομοιογενοποιημένο ανθρώπινο εγκέφαλο σε PBS, τιτλοποιημένο σε φιαλίδια του 1ml τα οποία φυλάσσονται σε -70ο C. Στην μέθοδο ΑΤΕ αντί ομοιογενοποιημένο εγκέφαλο χρησιμοποιούμε κύτταρα της κυτταρικής σειράς φλοιώματος D-54MG. Προϋπόθεση της μεθόδου αποτελεί η υπερεπάρκεια του αντιγόνου.
-2ml του αντιγόνου αναμιγνύονται με το ειδικό ραδιοσεσημασμένο (με 131-Ι) αντίσωμα και με μη-ειδικό αντίσωμα σεσημασμένο με 125-Ι το οποίο χρησιμοποιείται ως αρνητικός μάρτυρας.
-Φροντίζουμε ώστε να έχουμε 100.000 κρούσεις/λεπτό για κάθε αντίσωμα.
-Επωάζεται το μείγμα 2 ώρες με συνεχή ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου
-Το μείγμα φυγοκεντρείται 3 φορές και εκπλύεται διαδοχικά με PBS. Αφαιρείται το υπερκείμενο διάλυμα και ακολουθεί μέτρηση των κρούσεων στο γ-counter με ειδικό πρόγραμμα μέτρησης.
-Αφαιρούνται οι κρούσεις/λεπτό της μη-ειδικής σύνδεσης και εκφράζονται επί της % οι κρούσεις της ειδικής σύνδεσης που αντιπροσωπεύουν το ανοσολογικά ενεργό κλάσμα.
Β.4. Φυσικοχημική μέθοδος εκτίμησης του Ανοσολογικά ενεργού κλάσματος με την μέθοδο της υγράς Χρωματογραφίας (FPLC)
Η ραδιοσήμανση του μονοκλωνικού αντισώματος προκαλεί πολλές φορές αλλοίωση της δομής του, με αποτέλεσμα την δημιουργία συμπλόκων ανοσολογικά αδρανών. Η εκτίμηση του ανοσολογικού προτύπου του σεσημασμένου αντισώματος γίνεται με την μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας.
-Δείγμα του σεσημασμένου αντισώματος διέρχεται διαμέσου μεγάλης χρωματογραφικής στήλης σεφαρόζης της εταιρείας Pharmacia FC.
-Η ταχύτητα ροής της στήλης ρυθμίζεται σε 0,5ml/λεπτό. Η δυνατότητα της στήλης είναι 200μl.
-Ακολουθεί συλλογή των κλασμάτων, μέτρηση της ραδιενέργειας σε γ-counter και γραφική απεικόνιση του αποτελέσματος.
copyright © 2001-2002
